د.احمد محمد تركي
د. احمد عبد الجبار سليمان
نقل الجيناتGene Cloning
أن عملية نقل الجينات هي الحجر الاساس للهندسة الوراثية واغلب عمليات الوراثية الجزيئية وسهل نقل الجينات عملية تحليل مجين الكائنات بدائية وحقيقية النواة.
يمكن تقسيم عملية نقل الجينات الى خطوات رئيسية وكما يلي:-
1- عزل وتقسيم ال DNA قيد الدراسة والمستهدف من عملية النقل ويمكن ان يكون هذا DNA مادة وراثية كاملة او جين معاد تصنيعه من قالب RNA بواسطة reverse transcriptase او جين مضاعف باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل او جين مصنع كليا في المختبر , في حالة كون المصدر DNA كامل للخلية يمكن تقطيع القطعة المناسبة باستخدام الانزيمات القاطعة
2- ربط قطعة DNA المستهدفة في النقل الى ناقل كلونة مناسب باستخدام انزيم الربط DNA ligase .
نواقل الكلونة هي عبارة عن عناصر وراثية صغيرة الحجم تتضاعف ذاتيا باستقلالية عن الخلية وتستخدم لمضاعفة الجين ونقله وغاليا ماتكون بلازميدات او فايروسات. تصمم نواقل الكلونة لتسمح بادخال قطع مرغوبة من DNA فيها في المختبر في مواقع قطع معينة بحيث لاتؤثر على تضاعفها الذاتي . في كثير من الاحوال يتم قطع DNA المراد نقله وناقل الكلونة بواسطه نفس الانزيم القاطع وهذا يسهل عملية النقل واللحم بازدواج النهايات اللاصقةsticky end الناتجة من انزيم القطع اما النهايات الحادة Blunt endفيمكن لصقها باستخدام قطعة رابطة linker او قطعة محورة adaptor ويستخدم انزيم DNA ligase لربط الاصرة الفوسفاتية ثنائية الاستر .
3- ادخال وحفظ القطعة المكلونة في الكائن المضيف. وفي هذه العملية يتم ادخال القطعة في مع ناقل الكلونة المناسب والتي تم صنعها في المختبر الى كائن حي بواسطة التحول على سبيل المثال وفي الكائن الحي يتم مضاعفة القطعة الجديدة.
ان عملية نقل قطع DNA المرغوب الى كائن جديد وخصوصا في البكتريا عادة ماينتج متحولات عديدة clones والتي تختلف فيما بينها باختلاف مواقع ادخال الجين الجديد وبهذا ينتج لدينا مكتبة خاصة لكل بكتريا من حيث الجينات المدخلة ومواقع دخولها genetic library . وهذا يساعد في تحليل وضائف الجينات ورسم الخرائط الكروموسومية للعديد من الكائنات فضلا عن البكتريا .
نواقل الكلونة
اولا:- البلازميدات
من اكثر نواقل الكلونة استخداما هي البلازميدات. وهي كما مر سابقا قطع صغيره من DNA تتواجد في مختلف انواع البكتريا ولها وضائف مختلفة, من اهم صفات البلازميدات هي امتلاكها لاصل التضاعف او نقطة بدء التضاعف origin of replication والتي تلعب دور في تضاعف وصنع عدة نسخ من البلازميدات وتوزيع البلازميدات على الخلايا البنوية الناتجة .
ان الجين المراد ادخخاله ونقله هو عبارة عن قطعة من DNA لذا فان عملية ادخاله الى بلازميد مناسب يضمن انه يتضاعف بتضاعف البلازميد تحت ضروف خاصة او اثناء عملية تكاثر الخلايا.
هناك صفات اخرى للبلازميدات اعطتها الاهلية لتكون نواقل كلونه مناسة والاكثر استخداما في الهندسة لوراثية. في العادة البلازميدات تكون كبيرة نسبية more than 100kb ولكن البلازميدات المستخدمة في عمليات الكلونة تكون صغيرة نسبية less than 10kbوبذلك يسهل التعامل معها وتنقيتها بصوره كاملة. كما تحتوي البلازميدات المستخدمة في الكلونة صفات اختيارية عادة ماتكون مقاومة لمضاد حياتي معين وهذا يعني اننا نستطيع ان نعرف اي بكتريا تحتوي على البلازميد المرغوب والذي يحتوي على الجين المراد نقله بنشر البكتريا بعد ادخال البلازميد اختباريا على وسط اكار يحتوي على مضاد حياتي , وبذلك فالبكتريا الحاوية على البلازميد تنمو والبكتريا التي لاتحتوي البلازميد لاتستطيع النمو لانها لاتقاوم المضاد الذي عمل هنا كصفة اختيارية للبكتريا المهندسة وراثيا.
في هذه الحالة يجب ان تكون البكتريا اصلا غير مقاومة للمضادات الحياتية وتوجد عدة انواع بكتريا قياسية غير حاويه على مقاومة مضادات معينة.
اكثر البلازميدات استخداما في عملية الهندسة الوراثية هو بلازميد pBR322 والذي يعمل كناقل كلونة لبكتريا E. coli وهو بلازميد ممحور من هذه البكتريا له عدة صفات جعلته مؤهلا كناقل كلونة مناسب ومن هذه الصفات :-
1- صغير الحجم نسبيا حوالي4631bp
2- مستقر في البكتريا العائل E. coli وبعدد كبير نسبيا 20-30 نسخة لكل بكتريا طبيعيا
3- يمكن مضاعفة اعداده بشكل كبير جدا 1000-3000 نسخة لكل خلية وهو مايشكل حوالي 40% من الجينوم الكلية باستخدام مثبط لصناعة البروتين مثل مضاد الكلورومفنيكول
4- يمكن عزله بسهولة من الخلية بشكلة الملتف الفائق percoiled باستخدام طرق متعددة
5- يمكن ادخال كميات معقولة من الDNA الى هذا البلازميد على الرغم من انه الاحجام الكبيرة اكثر من 10000 قاعدة يمكن ان تؤدي الى عدم استقرار البلازميد وفقده من الخلية
6- كل تسلسل القواعد لهذا البلازميد معروفة وبذلك فان كل مواقع القطع معروفة وهذا يعطي حرية في اختيار القاطع المناسب ومكان الادخال المناسب
7- هناك مواقع قطع متفردة على هذا البلازميد لانزيمات متعددة مثل PstI, SaII, EcoRI, HindIII, and BamHI , ان وجود مواقع متفرده مهم جدا في عمليات نقل المادة الوراثية , حيث ان وجود مثل هكذا مواقع يتيح الحرية في قطع ناقل الكلونة في مكان واحد وتحويله لشكل خطي بدل من تقطيعه الى عدة قطع بوجود اكثر من موقع قطع.
8- لهذا البلازميد صفتين اختياريتين يوفرهما للمضيف وهي مقاومة مضاد الامبسلين ومقاومة التتراسيكلين,هذا يعطي حرية في اختيار البكتريا الحاوية على البلازميد المهندس وراثيا بوجود مقاومة كلا المضادين كما ان وجود مواقع مختلفة للقطع داخل جينات المقاومة تسهل عملية النقل بتخريب احد جينات المقاومة وبذلك يمكن بسهولة اختيار المتحولات .
9- يمكن ادخال هذا البلازميد بسهولة الى البكتريا بالتحول الحر او الصناعي
يمكن استخدام بلازميد pBR322 في عملية نقل الجينات الى بكتريا E. coli , من خلال الخارطة الجينية لهذا البلازميد الموضحه اعلاه يمكن ملاحظة احتواء جين مقاومة التتراسيكلين على موقع قطع BamH1 بينما يحتوي جين مقاومة الامبسيلين على موقع قطع PstI, في حالة نقل الجين قيد الدراسة الى موقع التتراسيكلين بقطعة باستخدام الانزيم القاطع BamH1 وقطع البلازميد بنفس الانزيم ومن ثم لحمه وادخاله الى الخلية . في عملية النقل هذه ستفقد البكتريا صفة المقاومة للتراسيكلين وتحتفظ بصفة مقاومة الامبسيلين وهذا يدعى عملية التثبيط بالادخال insertional inactivation , يتم اختيار المتحولات باستخدام تقنية replica plating بزرع الناتج من عملية التحول في طبق لايحوي اي مضاد ومن ثم طبع هذا الطبق الى طبقين احدهما يحوي التتراسيكلين والاخر يحوي الامبسلين . وبذلك فاي مستعمرة تنجح في النمو على طبق الامبسيلين وتفشل في النمو على طبق التتراسيكلين يعني ان المستعمره ناشئه من خليه اكتسبت الجين قيد الدراسة.
ثانيا :-العاثيات كنواقل كلونة((lambda bacteriophage
للعاثيات البكتيرية القدرة على اخذ جزء من جينوم المضيف اثناء النقل العام او المتخصص وبذلك فهي ملائمة للعمل كنواقل كلونة.
احد اكثر العاثيات استخداما في عمليات نقل الجينات هو العاثي لامدا, فخلال عملية النقل المتخصص يمكن استغلال العاثي لامدا كناقل كلونة, وقد جاء استخدامه من خلال معرفة صفاته الكاملة وتسلسله الكامل , وهو جدا مفيد من ناحية قدرته على حمل DNA جديد باحجام كبيرة نسبيا تصل الى 20kb وهي اكبر من ضعف قدرة البلازميدات وايضا يمكن تصنيع وتعبئة الفاج في المختبر وهذا يسهل عملية نقل الجينات الجديدة اليه. ويمكن استخدام العاثيات المحورة لاصابة بكتريا جديدة وكفاءه الاصابة اعلى كثيرا من كفاءه التحول البكتيري.
من خلال دراسة جينوم العاثي لامدا وجد ان ثلث الجينوم للعاثي غير مهم في عملية التعبئة والاصابة وتقع هذه المنطقه بيني جيني J and N في جينوم العاثي مما مكن العلماء من استبدال هذه المنطقة بالجينات الغريبة التي يراد ادخالها.
يحتوي الفاج لامدا على جين تصنيع B-galactosidase وهذا الجين يشطر جزيئة اللاكتوز ويعطي لون معين على وسط الاكار الخاص بهذا الكشف فعند استخدام هذا الوسط لتمنية بكتريا E. coli lac- واصابتها بالعاثي لامدا سوف يظهر لون نتيجة انتاج هذا الانزيم بواسطة النقل المتخصص للعاثي , اذا تم ادخال الجينات المرغوبة داخل هذا الجين واصابة البكتريا فسيتم اصابة البكتريا وانتاج plaques الخاصة بالعاثي ولكن من دون احداث تغيرات خاصة بانتاج الانزيم وبذلك يتم ضمان نجاح عملية ادخال الجينات المرغوبة.
Cloning with lambda replacement vectors involves the following steps
1.Isolating the vector DNA from phage particles and digestion with the
appropriate restriction enzyme.
2.Connecting the two lambda fragments to fragments of foreign DNA using DNA ligase.
3. Packaging of the DNA by adding cell extracts containing the head and tail proteins and allowing the formation of viable phage particles to occur
spontaneously.
4. Infecting E. coli and isolating phage clones by picking plaques on a host strain.
5. Checking recombinant phage for the presence of the desired foreign DNAsequence using nucleic acid hybridization procedures, DNA sequencing,or observation of genetic properties.
الكوزميدات Cosmids
وهو مزيج من البلازميدات والعاثيات حيث يمكن تعريفه على انه نقال كلونة بلازميدي يحتوي على DNA المراد نقله معه جين Cas المشفر للنهاية اللاصقة اللازمة لتعبئة الجينوم في راس العاثي .وبذلك يمكن لهذا الكوزمد التكاثر في البكتريا باعتبار له نقطة تضاعف البلازمد ويمكن ايضا تعبئته في راس العاثي virionلانه يحوي جين cas ولهذا الكوزمد صفات خاصة من حيث قدرته على حمل احجام كبيرة من DNA المراد نقله او دراسته حيث يصل الحجم المعبأ في الكوزميد الى 50kb وهذا يسهل عملية انتاج مكتبة جينية للكائن المراد دراسته كما يسهل عملية النقل المتخصص للجينات باستخدام العاثي transduction والتي تكون اكثر كفاءة من عملية transformatiom.
يمكن استغلال الكوزميدات لعملية حفظ الجينات لفترات طويله بتعبئتها في الكوزميدات وتحويلها الى virion ومن ثم حفظها لفترات طويلة وهي طريقة اكثر كفاءه من حفظها بشكل بلازميدات كونها اقل استقرارا من العاثيات .
للتحميل
docs.google.com
د. احمد عبد الجبار سليمان
نقل الجيناتGene Cloning
أن عملية نقل الجينات هي الحجر الاساس للهندسة الوراثية واغلب عمليات الوراثية الجزيئية وسهل نقل الجينات عملية تحليل مجين الكائنات بدائية وحقيقية النواة.
يمكن تقسيم عملية نقل الجينات الى خطوات رئيسية وكما يلي:-
1- عزل وتقسيم ال DNA قيد الدراسة والمستهدف من عملية النقل ويمكن ان يكون هذا DNA مادة وراثية كاملة او جين معاد تصنيعه من قالب RNA بواسطة reverse transcriptase او جين مضاعف باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل او جين مصنع كليا في المختبر , في حالة كون المصدر DNA كامل للخلية يمكن تقطيع القطعة المناسبة باستخدام الانزيمات القاطعة
2- ربط قطعة DNA المستهدفة في النقل الى ناقل كلونة مناسب باستخدام انزيم الربط DNA ligase .
نواقل الكلونة هي عبارة عن عناصر وراثية صغيرة الحجم تتضاعف ذاتيا باستقلالية عن الخلية وتستخدم لمضاعفة الجين ونقله وغاليا ماتكون بلازميدات او فايروسات. تصمم نواقل الكلونة لتسمح بادخال قطع مرغوبة من DNA فيها في المختبر في مواقع قطع معينة بحيث لاتؤثر على تضاعفها الذاتي . في كثير من الاحوال يتم قطع DNA المراد نقله وناقل الكلونة بواسطه نفس الانزيم القاطع وهذا يسهل عملية النقل واللحم بازدواج النهايات اللاصقةsticky end الناتجة من انزيم القطع اما النهايات الحادة Blunt endفيمكن لصقها باستخدام قطعة رابطة linker او قطعة محورة adaptor ويستخدم انزيم DNA ligase لربط الاصرة الفوسفاتية ثنائية الاستر .
3- ادخال وحفظ القطعة المكلونة في الكائن المضيف. وفي هذه العملية يتم ادخال القطعة في مع ناقل الكلونة المناسب والتي تم صنعها في المختبر الى كائن حي بواسطة التحول على سبيل المثال وفي الكائن الحي يتم مضاعفة القطعة الجديدة.
ان عملية نقل قطع DNA المرغوب الى كائن جديد وخصوصا في البكتريا عادة ماينتج متحولات عديدة clones والتي تختلف فيما بينها باختلاف مواقع ادخال الجين الجديد وبهذا ينتج لدينا مكتبة خاصة لكل بكتريا من حيث الجينات المدخلة ومواقع دخولها genetic library . وهذا يساعد في تحليل وضائف الجينات ورسم الخرائط الكروموسومية للعديد من الكائنات فضلا عن البكتريا .
نواقل الكلونة
اولا:- البلازميدات
من اكثر نواقل الكلونة استخداما هي البلازميدات. وهي كما مر سابقا قطع صغيره من DNA تتواجد في مختلف انواع البكتريا ولها وضائف مختلفة, من اهم صفات البلازميدات هي امتلاكها لاصل التضاعف او نقطة بدء التضاعف origin of replication والتي تلعب دور في تضاعف وصنع عدة نسخ من البلازميدات وتوزيع البلازميدات على الخلايا البنوية الناتجة .
ان الجين المراد ادخخاله ونقله هو عبارة عن قطعة من DNA لذا فان عملية ادخاله الى بلازميد مناسب يضمن انه يتضاعف بتضاعف البلازميد تحت ضروف خاصة او اثناء عملية تكاثر الخلايا.
هناك صفات اخرى للبلازميدات اعطتها الاهلية لتكون نواقل كلونه مناسة والاكثر استخداما في الهندسة لوراثية. في العادة البلازميدات تكون كبيرة نسبية more than 100kb ولكن البلازميدات المستخدمة في عمليات الكلونة تكون صغيرة نسبية less than 10kbوبذلك يسهل التعامل معها وتنقيتها بصوره كاملة. كما تحتوي البلازميدات المستخدمة في الكلونة صفات اختيارية عادة ماتكون مقاومة لمضاد حياتي معين وهذا يعني اننا نستطيع ان نعرف اي بكتريا تحتوي على البلازميد المرغوب والذي يحتوي على الجين المراد نقله بنشر البكتريا بعد ادخال البلازميد اختباريا على وسط اكار يحتوي على مضاد حياتي , وبذلك فالبكتريا الحاوية على البلازميد تنمو والبكتريا التي لاتحتوي البلازميد لاتستطيع النمو لانها لاتقاوم المضاد الذي عمل هنا كصفة اختيارية للبكتريا المهندسة وراثيا.
في هذه الحالة يجب ان تكون البكتريا اصلا غير مقاومة للمضادات الحياتية وتوجد عدة انواع بكتريا قياسية غير حاويه على مقاومة مضادات معينة.
اكثر البلازميدات استخداما في عملية الهندسة الوراثية هو بلازميد pBR322 والذي يعمل كناقل كلونة لبكتريا E. coli وهو بلازميد ممحور من هذه البكتريا له عدة صفات جعلته مؤهلا كناقل كلونة مناسب ومن هذه الصفات :-
1- صغير الحجم نسبيا حوالي4631bp
2- مستقر في البكتريا العائل E. coli وبعدد كبير نسبيا 20-30 نسخة لكل بكتريا طبيعيا
3- يمكن مضاعفة اعداده بشكل كبير جدا 1000-3000 نسخة لكل خلية وهو مايشكل حوالي 40% من الجينوم الكلية باستخدام مثبط لصناعة البروتين مثل مضاد الكلورومفنيكول
4- يمكن عزله بسهولة من الخلية بشكلة الملتف الفائق percoiled باستخدام طرق متعددة
5- يمكن ادخال كميات معقولة من الDNA الى هذا البلازميد على الرغم من انه الاحجام الكبيرة اكثر من 10000 قاعدة يمكن ان تؤدي الى عدم استقرار البلازميد وفقده من الخلية
6- كل تسلسل القواعد لهذا البلازميد معروفة وبذلك فان كل مواقع القطع معروفة وهذا يعطي حرية في اختيار القاطع المناسب ومكان الادخال المناسب
7- هناك مواقع قطع متفردة على هذا البلازميد لانزيمات متعددة مثل PstI, SaII, EcoRI, HindIII, and BamHI , ان وجود مواقع متفرده مهم جدا في عمليات نقل المادة الوراثية , حيث ان وجود مثل هكذا مواقع يتيح الحرية في قطع ناقل الكلونة في مكان واحد وتحويله لشكل خطي بدل من تقطيعه الى عدة قطع بوجود اكثر من موقع قطع.
8- لهذا البلازميد صفتين اختياريتين يوفرهما للمضيف وهي مقاومة مضاد الامبسلين ومقاومة التتراسيكلين,هذا يعطي حرية في اختيار البكتريا الحاوية على البلازميد المهندس وراثيا بوجود مقاومة كلا المضادين كما ان وجود مواقع مختلفة للقطع داخل جينات المقاومة تسهل عملية النقل بتخريب احد جينات المقاومة وبذلك يمكن بسهولة اختيار المتحولات .
9- يمكن ادخال هذا البلازميد بسهولة الى البكتريا بالتحول الحر او الصناعي
يمكن استخدام بلازميد pBR322 في عملية نقل الجينات الى بكتريا E. coli , من خلال الخارطة الجينية لهذا البلازميد الموضحه اعلاه يمكن ملاحظة احتواء جين مقاومة التتراسيكلين على موقع قطع BamH1 بينما يحتوي جين مقاومة الامبسيلين على موقع قطع PstI, في حالة نقل الجين قيد الدراسة الى موقع التتراسيكلين بقطعة باستخدام الانزيم القاطع BamH1 وقطع البلازميد بنفس الانزيم ومن ثم لحمه وادخاله الى الخلية . في عملية النقل هذه ستفقد البكتريا صفة المقاومة للتراسيكلين وتحتفظ بصفة مقاومة الامبسيلين وهذا يدعى عملية التثبيط بالادخال insertional inactivation , يتم اختيار المتحولات باستخدام تقنية replica plating بزرع الناتج من عملية التحول في طبق لايحوي اي مضاد ومن ثم طبع هذا الطبق الى طبقين احدهما يحوي التتراسيكلين والاخر يحوي الامبسلين . وبذلك فاي مستعمرة تنجح في النمو على طبق الامبسيلين وتفشل في النمو على طبق التتراسيكلين يعني ان المستعمره ناشئه من خليه اكتسبت الجين قيد الدراسة.
ثانيا :-العاثيات كنواقل كلونة((lambda bacteriophage
للعاثيات البكتيرية القدرة على اخذ جزء من جينوم المضيف اثناء النقل العام او المتخصص وبذلك فهي ملائمة للعمل كنواقل كلونة.
احد اكثر العاثيات استخداما في عمليات نقل الجينات هو العاثي لامدا, فخلال عملية النقل المتخصص يمكن استغلال العاثي لامدا كناقل كلونة, وقد جاء استخدامه من خلال معرفة صفاته الكاملة وتسلسله الكامل , وهو جدا مفيد من ناحية قدرته على حمل DNA جديد باحجام كبيرة نسبيا تصل الى 20kb وهي اكبر من ضعف قدرة البلازميدات وايضا يمكن تصنيع وتعبئة الفاج في المختبر وهذا يسهل عملية نقل الجينات الجديدة اليه. ويمكن استخدام العاثيات المحورة لاصابة بكتريا جديدة وكفاءه الاصابة اعلى كثيرا من كفاءه التحول البكتيري.
من خلال دراسة جينوم العاثي لامدا وجد ان ثلث الجينوم للعاثي غير مهم في عملية التعبئة والاصابة وتقع هذه المنطقه بيني جيني J and N في جينوم العاثي مما مكن العلماء من استبدال هذه المنطقة بالجينات الغريبة التي يراد ادخالها.
يحتوي الفاج لامدا على جين تصنيع B-galactosidase وهذا الجين يشطر جزيئة اللاكتوز ويعطي لون معين على وسط الاكار الخاص بهذا الكشف فعند استخدام هذا الوسط لتمنية بكتريا E. coli lac- واصابتها بالعاثي لامدا سوف يظهر لون نتيجة انتاج هذا الانزيم بواسطة النقل المتخصص للعاثي , اذا تم ادخال الجينات المرغوبة داخل هذا الجين واصابة البكتريا فسيتم اصابة البكتريا وانتاج plaques الخاصة بالعاثي ولكن من دون احداث تغيرات خاصة بانتاج الانزيم وبذلك يتم ضمان نجاح عملية ادخال الجينات المرغوبة.
Cloning with lambda replacement vectors involves the following steps
1.Isolating the vector DNA from phage particles and digestion with the
appropriate restriction enzyme.
2.Connecting the two lambda fragments to fragments of foreign DNA using DNA ligase.
3. Packaging of the DNA by adding cell extracts containing the head and tail proteins and allowing the formation of viable phage particles to occur
spontaneously.
4. Infecting E. coli and isolating phage clones by picking plaques on a host strain.
5. Checking recombinant phage for the presence of the desired foreign DNAsequence using nucleic acid hybridization procedures, DNA sequencing,or observation of genetic properties.
الكوزميدات Cosmids
وهو مزيج من البلازميدات والعاثيات حيث يمكن تعريفه على انه نقال كلونة بلازميدي يحتوي على DNA المراد نقله معه جين Cas المشفر للنهاية اللاصقة اللازمة لتعبئة الجينوم في راس العاثي .وبذلك يمكن لهذا الكوزمد التكاثر في البكتريا باعتبار له نقطة تضاعف البلازمد ويمكن ايضا تعبئته في راس العاثي virionلانه يحوي جين cas ولهذا الكوزمد صفات خاصة من حيث قدرته على حمل احجام كبيرة من DNA المراد نقله او دراسته حيث يصل الحجم المعبأ في الكوزميد الى 50kb وهذا يسهل عملية انتاج مكتبة جينية للكائن المراد دراسته كما يسهل عملية النقل المتخصص للجينات باستخدام العاثي transduction والتي تكون اكثر كفاءة من عملية transformatiom.
يمكن استغلال الكوزميدات لعملية حفظ الجينات لفترات طويله بتعبئتها في الكوزميدات وتحويلها الى virion ومن ثم حفظها لفترات طويلة وهي طريقة اكثر كفاءه من حفظها بشكل بلازميدات كونها اقل استقرارا من العاثيات .
للتحميل
docs.google.com
